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大肠杆菌含有2000种以上的蛋白质，为了分离它所表达的一个外源基因的产物并保持它的活性，常有很大困难。但为了某种目的，请根据下列要求写出具体的方法。 ⑴利用溶解度差别进行分离。 ⑵利用蛋白质分子大小进行分离。 ⑶根据不同电荷进行分离。 ⑷以制备有该产物的抗体进行分离。 ⑸产物的浓缩。 ⑹纯度的鉴定。
题目
大肠杆菌含有2000种以上的蛋白质，为了分离它所表达的一个外源基因的产物并保持它的活性，常有很大困难。但为了某种目的，请根据下列要求写出具体的方法。 ⑴利用溶解度差别进行分离。 ⑵利用蛋白质分子大小进行分离。 ⑶根据不同电荷进行分离。 ⑷以制备有该产物的抗体进行分离。 ⑸产物的浓缩。 ⑹纯度的鉴定。
参考答案和解析
正确答案:首先要有一种或几种检测或鉴定外源基因表达产物的方法，然后，在每一次分离纯化后检测表达产物存在哪一个级分中。⑴用硫酸铵或酒精分级沉淀，可根据蛋白质的溶解度的差别进行分离。⑵SDS-PAGE、凝胶过滤、超离心，以及超滤可对分子量不同的蛋白质进行分离。⑶对带电行为不同的蛋白质可以用离子交换层析、等电聚焦、圆盘电泳、毛细管电泳等方法进行分离；但是在使用这一类型的方法时选择溶液的pH值至关重要，因为蛋白质的带电行为和溶液的pH值密切相关。⑷如果具备表达产物的抗体，则可以使用亲和层析或免疫沉淀的方法简洁的分离所需的表达产物。⑸使用吸附量较大的离子交换层析和亲和层析，以及对饱和硫酸铵或聚乙二醇反透析，还有冷冻干燥等方法都可以达到浓缩样品的目的，然而这些方法使用时，都存在着拖延或除去小分子化合物的问题。相比而言，选用合适截流分子量的超滤膜，进行超过滤，往往能同时达到浓缩样品和去盐（包括小分子）的目的。⑹在上述的（2）和（3）这两大类用于分离纯化产物的过程，实际上也有样品纯度鉴定的作用。此外，末端分析、质谱和反相的HPLC层析也都是有效的样品纯度鉴定的方法。但是应注意，样品的纯度是一个相对的概念。
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相似问题和答案
第1题：
不适合在大肠杆菌中表达的外源基因是
A．真核cDNA
B．真核基因组DNA
C．质粒DNA
D．M13噬菌体DNA
正确答案：B
第2题：
克隆质粒载体的基本组成有
A.含有可利用宿主细胞复制系统复制起始的区域
B.含有一个或多个抗性基因的表达区域
C.含有用于外源基因的DNA限制性内切酶作用位点
D.含有多克隆位点
E.克隆质粒利用自身的复制酶系统，对外源基因进行扩增
B.含有一个或多个抗性基因的表达区域
C.含有用于外源基因的DNA限制性内切酶作用位点
D.含有多克隆位点
E.克隆质粒利用自身的复制酶系统，对外源基因进行扩增
答案：A,B,C,D
解析：
第3题：
为了减轻工程菌代谢负荷,提高外源基因表达水平可采取什么措施?
参考答案：将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段。
第4题：
在大肠杆菌中，外源基因表达产物的主要形式为（）和（）。
正确答案:可溶性蛋白；不溶性蛋白
第5题：
含有-SH基的蛋白质用以下哪种方法分离效果最好？（）
- A、共价色层
- B、金属螯合色层
- C、离子交换色层
- D、疏水色层
正确答案:A
第6题：
影响外源基因在大肠杆菌中高效表达的因素有哪些?
答案：
解析：
(1)启动子的强弱(2分);(2)基因的剂量(2分);(3)影响RNA转录和翻译效率的因素:SD序列mRNA(2分);(4)外源基因密码子的选择(2分);(5)表达产物的大小和稳定性(2分,以上五点均需进-步展开)。
第7题：
某一质粒载体如图6所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活
(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH I酶切后,与用BamH I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有____(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述三种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是____；并且含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞也是不能区分的，其原因是____。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有____的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自____。
(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH I酶切后,与用BamH I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有____(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述三种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是____；并且含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞也是不能区分的，其原因是____。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有____的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自____。
答案：
解析：
(1)能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点(答出两点即可) (2)二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长：二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长；四环素
(3)受体细胞
解析：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。
(2)依题意可知，目的基因插入位点在Tetr中，导致四环素抗性基因(TEtr)失活，而氨苄青霉素抗性基因(Ampr)仍能行使正常功能。如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞,因二者均不含氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上都不能生长,所以是不能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都能生长,因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落,还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。
(3)噬菌体是专性在细菌细胞中寄生的细菌病毒。在侵染细菌时，噬菌体的DNA进入到细菌细胞中，而其蛋白质外壳留在细胞外；在噬菌体DNA的指导下，利用细菌细胞中的物质和能量合成噬菌体的组成成分。其DNA复制所需的原料来自宿主(受体)细胞，即大肠杆菌。
(3)受体细胞
解析：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。
(2)依题意可知，目的基因插入位点在Tetr中，导致四环素抗性基因(TEtr)失活，而氨苄青霉素抗性基因(Ampr)仍能行使正常功能。如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞,因二者均不含氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上都不能生长,所以是不能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都能生长,因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落,还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。
(3)噬菌体是专性在细菌细胞中寄生的细菌病毒。在侵染细菌时，噬菌体的DNA进入到细菌细胞中，而其蛋白质外壳留在细胞外；在噬菌体DNA的指导下，利用细菌细胞中的物质和能量合成噬菌体的组成成分。其DNA复制所需的原料来自宿主(受体)细胞，即大肠杆菌。
第8题：
应用转化，转染技术
A、基因载体的切割
B、外源基因与载体拼接
C、重组DNA分子导入受体细胞
D、筛选含有重组分子的受体细胞
E、表达目的基因编码的蛋白质
正确答案：C
第9题：
简述大肠杆菌作为宿主表达真核蛋白质的特点。
正确答案: 表达基因产物形式多样：细胞内不溶性表达（包含体）、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。真核生物的目的蛋白在原核细胞中主要是包含体、融合蛋白、寡聚型外源蛋白、整合型外源蛋白、分泌型外源蛋白等。
大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
蛋白质不能糖基化。
目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。
其内毒素很难除去。
第10题：
提高外源基因在大肠杆菌中表达水平的措施有（）。
- A、调整SD序列与ATG之间的距离
- B、用点突变的方法改变起始密码子下游的几个密码子
- C、增加mRNA的稳定性
- D、使细菌的生长与外源基因的表达分开
- E、提高表达蛋白的稳定性
正确答案:A,B,C,D,E