生物学
PCR引物设计的基本要求是什么？
题目
PCR引物设计的基本要求是什么？
参考答案和解析
正确答案:
1、引物长度一般为15～30个核苷酸。过短影响PCR的特异性，过长会提高相应退火温度，使延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74℃，影响产物的生成。
2、引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3’端不应有连续3个G和C。否则会使引物和模板错误配对。G+C含量一般占45％-55％。3’端和5’端引物具有相似的Tm值，Tm值计算公式：Tm＝4（G+C.+2（A+T）
3、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。
4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠。
5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70％，引物3’末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
6、引物3’端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3’端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。
7、引物与模板结合时，引物的5’端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。
8、引物的5’端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。
2、引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3’端不应有连续3个G和C。否则会使引物和模板错误配对。G+C含量一般占45％-55％。3’端和5’端引物具有相似的Tm值，Tm值计算公式：Tm＝4（G+C.+2（A+T）
3、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。
4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠。
5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70％，引物3’末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
6、引物3’端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3’端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。
7、引物与模板结合时，引物的5’端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。
8、引物的5’端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。
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相似问题和答案
第1题：
PCR-SSP序列特异性引物PCR(名词解释)
本题答案：是根据等位基因的序列，设计具有序列特异性的引物，对样本进行DNA分型。该方法是以引物决定分型特异性。有以下优点：特异性强、重复性好、结果易于判定。
第2题：
设计PCR引物时
A.不需要考虑GC的含量
B.不需要考虑引物的长度
C.只需要考虑碱基互补
D.需要考虑模板的方向性
B.不需要考虑引物的长度
C.只需要考虑碱基互补
D.需要考虑模板的方向性
答案：D
解析：
第3题：
多重PCR需要的引物对为
A、一对引物
B、半对引物
C、两对引物
D、两对半引物
E、多对引物
参考答案：E
第4题：
什么叫PCR的引物？什么叫特异性引物？什么叫简并性引物？
正确答案: 引物：所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的5’末端位置。（引物要大大过量）
特异性引物：引物是与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。
简并性引物：简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。
第5题：
巢式PCR与普通PCR相比（）
- A、普通PCR比巢式PCR敏感
- B、所用酶不同
- C、所用底物不同
- D、模板不同
- E、前者用两对引物，后者用一对引物
正确答案:E
第6题：
PCR技术中，扩增引物的设计无需考虑
A、引物长度
B、靶序列长度
C、引物二聚体形成
D、引物自身杂交
E、引物3′端内的已知靶序列或未知靶序列
参考答案：B
第7题：
PCR-SSP序列特异性引物PCR
正确答案: 是根据等位基因的序列，设计具有序列特异性的引物，对样本进行DNA分型。该方法是以引物决定分型特异性。有以下优点：特异性强、重复性好、结果易于判定。
第8题：
巢式PCR与普通PCR不同的是
A、普通PCR比巢式PCR特异性高
B、酶不同
C、底物不同
D、模板不同
E、前者用2对引物，后者用1对引物
参考答案：E
第9题：
以下关于PCR的说法错误的是（）
- A、PCR反应必须要有模板、引物、dNTP和DNA聚合酶
- B、应用PCR技术可以进行定点突变
- C、PCR的引物必须完全和模板互补配对
- D、PCR反应中，仅介于两引物间的DNA片段得到大量扩增
正确答案:C
第10题：
对于镰状细胞贫血病的突变机理可以采用的基因诊断方法不可以是（）。
- A、设计等位基因特异性引物进行PCR
- B、测序
- C、PCR与限制性核酸内切酶技术结合
- D、核酸分子杂交
- E、在突变位点两侧设计引物再电泳分析PCR产物长度变化
正确答案:E